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临床微生物检验 - 基础知识-常用的微生物培养基

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虽然自动化仪器已经开始占领了微生物检验的市场,但是其成本是十分的高,特别是基层医院很难用的起,所以我们不要忘了基础的东西,从基础一步一步去掌握我们的任何一个实验室项目。不要因为有仪器直接给出相对正确的结果而忽略了您应该知道的基础知识。

文字是枯燥的,微生物也是枯燥的,忍受文字上带来的不悦,耐心的和我一起学习去,也许就会带来精神上的升华和临床技术水平的提高。


第三节:常用的微生物培养基

3.1培养基的组成成分

3.1.1营养物质

细菌需要的基础营养物质应含有氮源、碳源、无机盐类和生长因子等,常用的营养物质如下:

蛋白胨提供氮源。是动物或植物蛋白质经酶或酸碱分解而成。含胨、多肽和多种氨基酸,为大多数细菌生长所利用,尤其是含大量色氨酸的胰蛋白胨,更适于测靛基质用的蛋白胨。蛋白胨易溶于水,遇酸不沉淀,不因受高温而凝固,并对两性电解质有缓冲作用。但吸水性强,应注意干燥密封保存。

肉浸液是用新鲜牛肉浸泡、煮沸而制成的肉汁。其中含有可溶性含氮浸出物(肌酸、黄嘌呤、腺嘌呤、次黄嘌呤核苷酸、谷氨酸、甘氨酸等)和非含氮浸出物(肝糖、乳酸、琥珀酸、磷酸己糖、脂肪、无机盐类等)。还有一些生长因子。肉浸液提供氮源和碳源,但肉浸液中所含氮物质过少而不能满足细菌的需要,因此在制备培养基时应再加入1%~2%的蛋白胨和0.5%氯化钠。

牛肉膏由肉浸液经长时间加热浓缩而制成。糖类在加热过程中被破坏,所以其营养价值低于肉浸液,但因无糖可用作肠道杆菌鉴别培养基的基础成分。由于使用方便,常用于制备培养基。

糖类、醇类提供碳源和能源。制备培养基所用的糖类、醇类有多种,常用的糖类有单糖(葡萄糖、阿拉伯糖等)、双糖(乳糖、蔗糖等)和多糖(淀粉、菊糖等);常用的醇类有甘露醇、卫茅醇等。除葡萄糖、蔗糖主要作为碳源和能源的基本成分外,其他糖类和醇类主要用于鉴定细菌所做的发酵反应。

无机盐类提供细菌生长的各种元素,如:钾、钠、铁、镁、钙、磷、硫等。用于制备培养基的无机盐类有多种,其中最常用的有氯化钠和磷酸盐,前者对维持酶的活性、调节菌体内外的渗透压非常重要,后者是细菌良好的磷源,并在培养基中具有缓冲作用。

鸡蛋和动物血清虽然不是构成培养基的基本成分,但却是某些细菌生长所必需的营养物质,所以仅用于制备一些特殊的培养基,这些细菌直接从鸡蛋和动物血清中获取营养。如培养结核分枝杆菌的鸡蛋培养基和培养白喉杆菌的吕氏血清培养基等。

生长因子是细菌生长所必需的,但需要量很小。在制备培养基时,常在肝浸液、肉浸液、酵母浸液和含血液培养基中加入维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等生长因子。

3.1.2凝固物质:制备固体培养基时,需要在液体中加入凝固物质。最常用的凝固物质为琼脂,特殊情况下也可用明胶、卵白蛋白、血清等。无营养作用。

3.1.3抑制剂和指示剂:用于选择、鉴定及判断结果。

抑制剂有选择抑制作用,抑制非检出菌(非病原菌)的生长,以利于检出菌(病原菌)的生长。常用的有胆盐、煌绿、亚硫酸钠、亚硒酸钠及一些染料和某些抗生素等。

指示剂:观察细菌是否利用和分解培养基中的糖、醇类。常用的有酚红、中性红、甲基红、溴甲酚紫、溴麝香草酚蓝、中国蓝等酸碱指示剂。亚甲蓝常用作氧化还原指示剂。

3.2培养基种类

3.2.1基础培养基:含有基础生长所需的基本营养成分,最常用的是肉浸液,俗称肉汤,主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。基础培养基广泛用于细菌的增菌、检验,也是制备其他培养基的基础成分。

3.2.2营养培养基:在基础培养基中可加入葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分,供营养要求较高的细菌和需要特殊生长因子的细菌生长。最常用的是血琼脂平板、巧克力血平板(如下)等。

3.2.3鉴别培养基:利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同,在培养基中加入特定的作用底物和指示剂,观察细菌生长过程中分解底物所释放的不同产物,通过指示剂的反应不同来鉴别细菌。如糖发酵管、克氏双糖铁琼脂(KIA)、伊红-亚甲蓝琼脂和动力-吲哚-尿素(MIU)培养基等。

3.2.4选择培养基;在培养基中加入抑制剂,去抑制标本中的杂菌生长,有助于所选择的细菌种类的生长。例如培养肠道致病菌的SS琼脂,其中的胆盐能抑制革兰阳性菌,枸橼酸钠和煌绿能抑制大肠埃希菌,因而使致病的沙门菌、志贺菌容易分离到。

3.2.5特殊培养基:包括厌氧培养基和细菌L型培养基等。前者是培养专性厌氧菌的培养基,除含营养成分外,还加入还原剂以降低培养基的氧化还原电势,如疱肉培养基、巯基乙醇酸钠培养基等。后者是针对细胞壁缺损的细菌L型,由于胞内渗透压较高,故培养该菌时必须采用高渗(3%~5%NaCl、10%~20%蔗糖或7%聚乙烯吡咯烷酮等)低琼脂培养基。

3.3分离培养基的选择:临床标本送往细菌实验室后,应立即接种到适当的分离培养基上。依据卫生部临床检验中心推荐,细菌实验室应备有如下分离培养基:

3.3.1血平板适于各类细菌的生长,一般细菌检验标本的分离,都应接种此平板。

3.3.2巧克力血平板其中含有V和X因子,适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。

3.3.3中国蓝平板或伊红亚甲蓝平板可抑制革兰阳性细菌,有选择地促进革兰阴性细菌生长,是较好的弱选择性培养基。发酵型革兰阴性杆菌因分解乳糖能力不同,在此平板上菌落颜色不同,便于鉴别菌种。

3.3.4麦康凯平板具中等强度选择性,抑菌力略强,有少数革兰阴性菌不生长。在麦康凯平板上能否生长,是不发酵菌鉴定的一个依据。

3.3.5.SS琼脂有较强的抑菌力,用于志贺菌和沙门菌的分离。因选择性过强,可影响检出率,所以,使用时最好加一种弱选择平板以配对互补。

3.3.6.碱性琼脂或TCBS琼脂用于从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌。

3.3.7血液增菌培养基用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。

3.3.8营养肉汤用于标本及各类细菌的增菌培养。

3.3.9 MH琼脂平板用于细菌的抗生素敏感试验。MH琼脂平板是WHO推荐的适用于K-B法测定细菌对抗菌药物敏感性的培养基对于同种细菌不同药敏纸片,抑菌环越大,表示抗生素对此细菌抑制能力越强。反之越弱。

3.3.10沙保弱培养基:白色念珠菌的鉴定和培养将检材接种于沙保弱琼脂培养基,摄氏25度孵育3-4天后,即可在培养基表面形成乳白色(偶见淡黄色)类酵母菌落。

3.3.11念珠菌显色培养基用于白色念珠菌分离和鉴定通过显色来区别不同念珠菌,白色念球菌显蓝绿色,热带念珠菌显蓝灰色或铁蓝色,光滑念珠菌显紫色,克柔假丝酵母显粉色,其它显白3.3.12B群链球菌显色平板添加了特异性的酶底物,经B群链球菌的酶解作用释放出显色原从而使细菌呈现出不同的颜色淡红色到深红色是B群链球菌。蓝色,绿色,无色或被抑制是其他细菌。

 

3.4根据标本来源和可能存在的病原菌,确定选用各种分离培养基

大部分细菌培养的标本血平板、巧克力平板

粪便标本---EMB、SS、MAC、TCBS

酵母样真菌培养---念珠菌显色平板、沙保弱平板

淋病培养标本淋球菌平板

中段尿---血平板,若做菌落计数时,可联合血平板、普通营养琼脂,及或麦康凯(或中国蓝)

脑脊液标本---血琼脂、巧克力琼脂、麦康凯或中国蓝平板、CHROMagar或者沙保罗琼脂。若怀疑有专性厌氧菌感染时,可增加厌氧培养基。

痰标本--血平板、加万古霉素的巧克力平板、CHROMagar或含氯霉素的SDA等。

疑白喉--亚碲酸钾血琼脂、吕氏血清斜面或鸡蛋斜面。

疑为百日咳杆菌--鲍-金(Bordet-Gengou)平板。

疑金葡感染致伪膜性肠炎的粪便标本---叠氮钠血琼脂,亦可用选择性培养基

疑似霍乱弧菌感染的粪便标本----碱性蛋白胨水

怀疑有苛养菌(淋球菌、杜克雷嗜血杆菌等)感染者的尿细菌培养--加种巧克力培养基和TM培养基。

 

信息来源:司南说检验微信公众号

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